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光子臭氧用于真菌殺滅的觀察

1．材料
    1.1 便攜式交直流兩用臭氧發(fā)生器(簡稱光子臭氧發(fā)生器)，屬高新科技專利產(chǎn)品(專利號：89211425.8)。功率：4W／只，電壓：220V或DC6V，容積5L(塑料袋)。
     1.2 真菌由自來水或大氣自然污染中分離。
     1.3 小號玻璃培養(yǎng)皿，15只。
     1.4 Eagle培養(yǎng)液，日本產(chǎn)。

2．方法
     2.1 將小號玻璃培養(yǎng)皿用自來水洗滌后，打開皿蓋，暴露于空氣2-3小時(shí)(h)，再移入56℃衡溫箱內(nèi)干燥2-3h，然后分成對照及試驗(yàn)兩組。
     2.2 試驗(yàn)組置于容積為5L的塑料袋內(nèi)，同時(shí)放入功率為4w／只交流電光子0₃發(fā)生器，以>100mg／m3 03濃度，按不同時(shí)間進(jìn)行滅菌。
     2.3 將平皿按有無作0₃殺菌來劃分對照及試驗(yàn)兩組，其他操作內(nèi)容兩組相同；分別按無菌操作加入真菌培養(yǎng)液，每皿3ml，置于37℃衡溫箱內(nèi)孵育足五天觀察結(jié)果。
     2.4 培養(yǎng)液按配方制備后，分裝小試管，每管3ml，再行121℃高溫高壓消毒15分鐘，后置冰箱內(nèi)備用。
     2.5 觀察指標(biāo)
         2.5.1 培養(yǎng)液是否混濁；
         2.5.2 培養(yǎng)液面有無菌落；
         2.5.3 培養(yǎng)液內(nèi)有無絮狀菌絲出現(xiàn)，以單個(gè)菌絲團(tuán)為單元進(jìn)行計(jì)數(shù)；
         2.5.4 以培養(yǎng)液清晰、液面無菌落、液內(nèi)無菌絲為陰性，反之為陽性。
         2.5.5 對照組：包括培養(yǎng)液作空白對照；未經(jīng)O₃殺菌的平皿作為陽性對照。
     2.6 滅菌率：對照組菌絲團(tuán)數(shù)-試驗(yàn)組殘存菌絲團(tuán)數(shù)×100％對照組菌絲團(tuán)數(shù)

3．結(jié)果

     表1光子O₃對真菌作用時(shí)間與轉(zhuǎn)陰率觀察
注：從陰陽件數(shù)比例計(jì)算轉(zhuǎn)陰率
    表 l 顯示:當(dāng)0₃作用1.3h，其轉(zhuǎn)陰率未超過50%；當(dāng)0₃作用4h，其轉(zhuǎn)陰率上升到66.7%：當(dāng)0₃作用6h，其轉(zhuǎn)陰率達(dá)到100%。由此表明，隨著O₃對真菌作用時(shí)間的延長，其轉(zhuǎn)陰率也隨即提高。
     表 2 對照組顯示:如序號(2)、(3)，其菌量為9、10，及序號(4)，其菌量為190、210所示，平皿洗滌后，打開皿蓋，暴露于空氣與否，后置56℃衡溫箱或室內(nèi)干燥，其受污菌量則無明顯差異。

4．討論
     4.1 O₃對真菌的殺滅作用。按真菌培養(yǎng)要求，以一日24h連續(xù)培養(yǎng)5日(120h)未出現(xiàn)菌絲團(tuán)為陰性。如表l所示，當(dāng)O₃濃度>100mg／m³(即>0.1mg／L)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0₃能完全殺滅真菌，但0₃需持續(xù)作用4-6h。采用如此高濃度0₃才能殺滅真菌，也顯示真菌的抵抗力非同一般，比細(xì)菌強(qiáng)得多，甚至比滅活乙肝病毒表面抗原(HBSAg)的0₃濃度(>60mg/m³/h)(1）還要高，時(shí)間長。0₃對真菌的殺滅時(shí)間竟需達(dá)數(shù)小時(shí)，這與真菌的結(jié)構(gòu)有關(guān)，真菌的細(xì)胞壁厚而堅(jiān)固，它由多糖和多糖蛋白復(fù)合物構(gòu)成。大多數(shù)真菌胞壁的多糖是幾丁質(zhì)，它是一種含氮的多糖。據(jù)1936年有學(xué)者在密閉的容器內(nèi)用環(huán)氧乙烷80mg/L殺滅面包店設(shè)備上的霉菌孢子，發(fā)現(xiàn)達(dá)到滅菌時(shí)間為16h；1946年又有學(xué)者以提高環(huán)氧乙烷濃度為160mg/l于密閉容器內(nèi)，86℉下殺滅瓊脂斜面上生長的真菌，3h達(dá)到滅菌(2)。眾所周知．環(huán)氧乙烷穿透性強(qiáng)，殺菌率高，但毒性殘留明顯，難以用作食具消毒，更不可直接用于食品消毒。
     4.2 0₃殺滅真菌的機(jī)理探討。0₃既是屬于過氧化物類高效、快速、安全、無殘留的潔凈消毒劑，又是屬于氧化還原電位高(2.07 ev)的強(qiáng)氧化劑。0₃能殺滅細(xì)菌、病毒、真菌、芽胞、原蟲、包囊及蟲卵等。它能氧化分解細(xì)菌的葡萄糖氧化酶、脫氫氧化酶，還可直接與細(xì)菌發(fā)生作用，導(dǎo)致細(xì)菌物質(zhì)代謝氧化還原過程的破壞，使菌死亡。隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，微生態(tài)學(xué)將生態(tài)擴(kuò)展到分子水平。其實(shí)無論蛋白質(zhì)或核酸分子均屬有機(jī)物，它們都是由碳、氫、氧、氮及磷或硫(C、H、O、N、P或S)組成(3)同時(shí)，病毒的衣殼體是由許多蛋白質(zhì)亞單位即殼微粒組成。蛋白質(zhì)則由多鏈組成，核酸又由連在一起的。

     表2 光子O₃對真菌殺滅觀察
注：從滅菌量計(jì)算滅菌率
     核苷酸鏈組成。其中—OH，從整體看，它是電中性的(R-OH)，但從基團(tuán)的內(nèi)部看，它的一部分帶有更多的負(fù)電荷(如氧原子)，因基團(tuán)的這部分(R-OH)有“額外”的成鍵電子，所以帶負(fù)電；另一部分帶有更多的正電荷(如氫原子)，基團(tuán)的這部分缺乏成鍵電子，所以帶正電。若有另一個(gè)相似的基團(tuán)靠近，正、負(fù)電荷之間互相吸引便生成一個(gè)弱鍵，即稱氫鍵，如多肽的基團(tuán)之間或核苷酸的鹼基之間以及在DNA或RNA分子里的鹼基配對均容易形成氫鍵。雖然單個(gè)氫鍵非常弱，但是很多氫鍵在一起，從而構(gòu)成植物細(xì)胞堅(jiān)韌的細(xì)胞壁。現(xiàn)再看0₃，它是屬強(qiáng)氧化劑，氧化電位高，凡電負(fù)性高的元素能強(qiáng)烈地吸引電子、氧化對方，還原自己。氧化結(jié)果，導(dǎo)致核酸分解，蛋白質(zhì)解體；抗原變性，檢測轉(zhuǎn)陰；代謝終止，菌體死亡。
     4.3 真菌在自然界的分布及其危害。本實(shí)驗(yàn)所述對照組顯示，自來水或空氣中均有大量真菌存在。有報(bào)道：(4)牙簽、棉簽也有真菌污染，牙簽中總檢出率高達(dá)47.5-70%；滅菌棉簽中總檢出率為12.5-23.3%。這與其它學(xué)者的報(bào)道：(5)“真菌在自然界分布極為廣泛，無論是水、空氣、土壤、還是動植物上，均有真菌的存在”基本相符。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，有些植物寄生性真菌和腐生性真菌產(chǎn)生的毒素，對人和動物具有致病性。在消毒學(xué)上，對這類真菌及其毒素也應(yīng)倍加重視。由于食物中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，真菌污染食物的機(jī)會也特別多。大多數(shù)真菌在食物上的生長繁殖可造成食物的腐敗變質(zhì)，但一般不致病，少數(shù)真菌還可導(dǎo)致真菌病，在醫(yī)學(xué)上有重要意義。因此，食物的微生物污染和食品的消毒滅菌是當(dāng)今學(xué)者深為關(guān)注的課題。此外，在實(shí)驗(yàn)室的器材中，有不少是由塑料制品替代，如用于單克隆抗體制備的塑料板，不宜用高溫高壓作消毒滅菌，而先用酒精浸泡24h，隨后再用紫外線照射數(shù)小時(shí)，還難免仍有細(xì)菌真菌污染。制備單克隆過程，一旦遭受污染，則會影響總體實(shí)驗(yàn)材料全功盡棄。在此情況下，若將塑料板采用高濃度03消毒滅菌，它既能縮短消毒時(shí)間(<6h)，減輕勞力，節(jié)約耗資，且可確保消毒滅菌高效快速。
     光子0₃制備原理與傳統(tǒng)高壓放電產(chǎn)生0₃不同(6)它不用高壓電，不產(chǎn)生有毒有害的氮氧化物(NOX)致突試驗(yàn)陰性，其形成0₃的原理與高空臭氧層形成0₃的原理一致，但與雷電產(chǎn)生O，不同。光子O₃制備過程，是以空氣為原料，采用光子技術(shù)產(chǎn)生特定光譜(<200 nm)激發(fā)空氣中氧分子，經(jīng)Oz的化學(xué)反應(yīng)(離解聚合)形成高濃度0₃，體現(xiàn)就地取材(空氣)一服務(wù)人類一回歸自然，即0₃在常溫下轉(zhuǎn)化為氧回歸自然，符合綠色環(huán)保、生態(tài)平衡和“可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略”要求。人們完全能自由地駕馭0₃為人類服務(wù)的時(shí)代已經(jīng)到來。
     4.4 0₃用于食品、飲料消毒是一種理想選擇。
     對真菌的培養(yǎng)檢測用一般培養(yǎng)基不易檢出，而需用特殊培養(yǎng)基并需連續(xù)培養(yǎng)五日才獲結(jié)果。食品工業(yè)每年中秋月餅、西點(diǎn)巧克力及飲料果汁，在保質(zhì)期內(nèi)出現(xiàn)霉變現(xiàn)象時(shí)有所聞，當(dāng)然其中因素很多，但與消毒措施是否匹配、檢測要求是否到位不無關(guān)系。
     當(dāng)今0₃已被廣泛用于食品工業(yè)殺菌防霉。1997年美國食品與醫(yī)藥管理局(FDA)宣布放棄對食品加工使用0₃的限制政策，承認(rèn)0₃應(yīng)用于食品加工符合“通用安全標(biāo)準(zhǔn)”(GRAS)要求(7)，由此確定了0₃在食品加工業(yè)的新興消毒劑地位，這一聲明也成了O₃技術(shù)發(fā)展的里程碑。傳統(tǒng)的食品消毒殺菌方法已顯然不能滿足越來越高的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)踐證明，利用O₃殺菌譜廣、滅菌力強(qiáng)、消毒效果好、且無殘留，沒有二次污染的特性，有助于打破國際貿(mào)易中對農(nóng)副產(chǎn)品的技術(shù)壁壘，保持農(nóng)副產(chǎn)品在國際市場的競爭優(yōu)勢，具有現(xiàn)實(shí)和深遠(yuǎn)的意義。
     0₃的功能有：消毒滅菌；防霉保鮮；解毒凈化；除臭脫色；潔水增氧；氧化防污；醫(yī)療保健。臭氧被譽(yù)稱為少有的可直接對食品使用的“潔凈消毒劑”。0₃對人的健康有無影響，國內(nèi)外學(xué)者極為關(guān)注，研究甚多。從環(huán)境流行病學(xué)資料，沒有發(fā)現(xiàn)暴露于0₃等氧化劑與肺癌危險(xiǎn)性之間有任何關(guān)系，動物實(shí)驗(yàn)中亦沒得到致癌證據(jù)(8)。1995年報(bào)道：動物持續(xù)長期的吸入0₃試驗(yàn)，顯示0₃不致癌，0₃是迄今為止人類可利用的最強(qiáng)氧化劑。強(qiáng)氧化性滅菌消毒是世界衛(wèi)生消毒技術(shù)的發(fā)展方向。

參考資料：
     (1) “臭氧用于HBSAg的滅活”王芳《消毒與滅菌》6(3)P145，1989。
     (2) “環(huán)氧乙烷殺真菌作用”薛廣波《實(shí)用消毒學(xué)》P.279人民軍醫(yī)出版社1986。
     (3) “臭氧在微生態(tài)研究中的應(yīng)用”陳君勝等《動物微生態(tài)研究進(jìn)展》P.123中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000。
     (4) "牙簽、棉簽也有污染”，姚齊龍《大眾醫(yī)學(xué)》4(上半月)2003。
     (5) “真菌”薛廣波《實(shí)用消毒學(xué)》P54,P60同上。
     (6) “臭氧開發(fā)應(yīng)用作為‘可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略’實(shí)施的內(nèi)涵之一”，陳君勝等《中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)論壇》大型系列叢書1999。
     (7) “美國臭氧技術(shù)發(fā)展動態(tài)”Rip G．Rice((Ozone Science&Engineering))21(2)1999摘自《國外臭氧技術(shù)資料選譯》(1)臭氧技術(shù)信息服務(wù)網(wǎng)編印P.1—10 1999。
     (8) 《環(huán)境醫(yī)學(xué)》P46王紹漢等，天津科學(xué)技術(shù)出版社1987。

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