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水質（糞）大腸菌群快速檢驗紙片
分BD105Ⅰ和BD105Ⅱ兩個型號，請注意選擇型號。 1、適用范圍 水質（糞）大腸菌群的測定紙片快速法 本標準規定了總大腸菌群、糞大腸菌群的快速測定方法。 本標準適用于地表水、生活污水、醫療機構及禽畜養殖業等其他行業排放的廢水中（糞）大腸菌群的快速篩查。 本方法的檢出限為20MPN/L。 2、 2、規范性引用文件 本標準內容引用了下列文件或其中的條款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。HJ/T91地表水和污水監測技術規范 3、 3、術語和定義 下列術語和定義適用于本標準。 3.1總大腸菌群（total coliforms） 在37℃培養，24h內能發酵乳糖酸產氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
3.2 糞大腸菌群（fecal coliforms） 44.5℃培養，24h內能發酵乳糖產酸氣的總大腸菌群，屬糞行來源，稱為糞大腸菌群。 4、方法原理 將一定量的乳糖、指示劑（溴甲酚紫和2，3, 5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及營養成分等吸附于一定面積的無菌濾紙上，當細菌生長繁殖時，產酸使PH值降低，溴甲酚紫指示劑由紫色變黃色。同時，產氣過程相應的脫氫酶在適宜的PH范圍內，催化底物脫氫還原TTC形成紅色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在產酸后的黃色背景下顯示出紅色斑點（或紅暈）。通過上述指示劑的顏色變化就可對是否產酸產氣作出判斷，從而確定是否有（糞）大腸菌群存在，再通過查MPN表就可得出相應（糞）大腸菌群的濃度值。 5、試劑和材料 除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純化學試劑。 5.1市售水質總大腸菌群、糞大腸菌群測試片：10ml水樣量紙片按附錄A的方法進行質量鑒定，達到要求后方可使用。 5.2無菌水 用新制備的去離子水或蒸餾水，按無菌操作要求，121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。 5.3硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml 稱取硫代硫酸鈉10g，溶于適量蒸餾水（或去離子）中，稀釋至100ml，現配。 5.4乙二胺四乙酸二鈉（EDTA- Na2）溶液：ρ(C10H14N2O8Na2。 2H2O)=0.15g/ml 稱取EDTA-Na2 15g,溶于適量蒸餾水（或去離子水）中，稀釋至100ml，此溶液保質期為30d。 6 6、 儀器和設備 6.1 恒溫培養箱：37℃±1℃。 6.2 恒溫培養箱：44℃±0.5℃。 6.3 高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kpa。 6.4 冰箱：0-4℃ 6.5 移液管：1±0.01ml、10±0.1ml。 6.6 試管：φ15mm×150mm. 6.7 采樣瓶：500ml。 注1：移液器、試管、采樣瓶等玻璃器皿實驗前要按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌20min，烘干，備用。
6 7、樣品 用滅菌器具，按照HJ/T 91的規定及無菌操作的要求，采集水樣400ml放入已滅菌的采樣瓶中。如果是經加氯處理的廢水，需在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA- Na2）溶液（5.4）1.2ml，以消除干擾。酸性樣品，需調節胖胖的PH值至7.0-8.0。 采樣后2h內檢測，否則，需10℃以下冷藏并6h內送檢，實驗室接樣后，應將樣品放入0-4℃冰箱并2h內測定。 注2:10mg硫代硫酸鈉可保證去除水樣中1.5mg余氯，硫代硫酸鈉用量克根據水樣實際余氯量調整。
7 8、分析步驟 8.1接種量 每個樣品按三個不同的接種量接種，每個接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。 根據水樣的污染程度確定接種量，應盡可能使5個接種量最大的紙片為陽性、5個接種量最小的紙片為陰性。 清潔水樣的參考接種量分別為10 ml、1 ml、0.1 ml，受污染水樣參考接種量根據污染程度可接種1 ml、0.1ml、0.01 ml或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等，見下表1。 表1水樣接種量參考表 接種量小于1ml時，水樣應制成稀釋樣品后使用。接種量為0.1ml、0.01 ml時，分別制成1:10稀釋樣品、1:100稀釋樣品。其它接種量的稀釋樣品依次類推。 1:10稀釋樣品的制作方法為：吸取1ml水樣，注入盛有9 ml無菌水的試管中，混勻，制成1:10稀釋樣品。其它稀釋度的稀釋樣品同法制作。
8.2接種、培養 水樣充分混勻，按無菌操作制作稀釋水樣及接種水樣。 清潔水樣，接種水樣總量為55.5ml，10 ml水樣量紙片5張，每張接種水樣10ml，1 ml水樣量紙片10張，其中5張各接種水樣1ml，另5張各接種1:10的稀釋水樣1ml。受污染水樣，接種3個不同稀釋度的1ml稀釋水樣各5張。 接種水樣應均勻涂布于紙片上，紙片充分侵潤、吸收水樣，用手輕輕壓平，做好標記。 測總大腸菌群時，在37±1℃的條件下培養18-24h后觀察結果；測糞大腸菌群時，在44.5±0.5℃的條件下培養18-24h后觀察結果。 注3：1、檢測糞大腸菌群時，紙片接種后應立即放置于44.5±0.5℃的恒溫培養箱中培養，在常溫下放置過久將影響檢測結果的準確性。 2、紙片加入水樣后，短時間內變黃或退色，表明水樣存在酸性物質活氧化劑干擾，需按“7樣品”一節方法去除相應干擾。
8.3結果判定 （1）紙片上出現紅斑或紅暈且周圍變黃，為陽性。 （2）紙片全片變黃，無紅斑或紅暈，為陽性。 （3）紙片部分變黃，無紅斑或紅暈，為陰性。 （4）紙片的紫色背景上出現紅斑或紅暈，而周圍不變黃，為陰性。 （5）紙片無變化，為陰性。 結果判斷參照圖片見附錄B。 6 9、結果計算與表示 6.1 9.1結果計算 根據不同接種量的陽性紙片數量，查MPN表（附錄C），經下面的公司換算報告1L水中（糞）大腸菌群數： 6.2 9.2結果表示 測定結果保留二位有效數字，大于100時以科學計數法表示，結果的單位為MPN/L。平均值以幾何平均計算。 7 10、 精密度和準確度 微生物檢測書記為偏態分布，按其統計分析要求，其檢測所得MPN值全部經對數（以10為底）轉換后進行以下分析。 10.1精密度 6家實驗室分別對有證標準樣品（15600MPN/L）、低濃度（4.0×102 MPN/L）、中濃度（1.0×104 MPN/L）、高濃度（8.0×104MPN/L）實際樣品的總大腸菌群進行了測定，實驗室內相對標準偏差范圍分別為：4.5%～7.5%、3.5%～12.4%、4.5%～6.9%、2.8%～5.8%；實驗室間的相對標準偏差范圍分別為：3.3%、12.6%、4.6%、1.6%；重復限為0.61、0.67、0.67、0.64；再現性限為1.09、0.81、0.66、0.69。 6家實驗室分別對有證標準樣品（12100MPN/L）、低濃度（1.0×102 MPN/L）、中濃度（4.0×103 MPN/L）、高濃度（5.0×104 MPN/L）實際樣品的糞大腸菌群進行了測定，實驗室內的相對標準偏差范圍分別為：4.5%～11.3%、11.4%～31.3%、2.8%～21.5%、3.9%～13.2%；實驗室間的相對標準偏差分別為5.2%、14.8%、11.9%、8.2%。重復性限為0.93、0.83、0.85、0.77；再現性限為1.28、1.44、1.35、0.89。 10.2 10.2準確性 6家實驗室對總大腸菌群有證標準樣品（15600MPN/L）進行測定，實驗室內相對誤差的范圍是-5.5%~-12.8%，相當誤差的最終值為-8.8%±6.0%。 6家實驗室對糞大腸菌群有證標準樣品（12100MPN/L）進行測定，實驗室內相對誤差的范圍是-3.8%~-16.0%，相對誤差的最終值為-10.3%±9.2%。 11 11、 質量保證和質量控制 11.1應使用質量鑒定合格的紙片。 11.2每批樣品應用無菌水做全程序空白測定，培養后的紙片上不的有任何微生物生長，否則，該次樣品測定結果無效，應查明原因后重新測定。 11.3每批樣品應使用有證標準菌株進行陽性、陰性對照試驗�？偞竽c菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為金黃色葡萄菌；糞大腸菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為產氣腸桿菌。 上述標準菌株均制成濃度為300~3000個/ml的菌懸液，分別取相應水量的菌懸液接種紙片，按“8.2接種、培養”一節的要求培養，大腸埃希氏菌應呈現陽性反應；金黃色葡萄球菌、產氣腸桿菌應呈現陰性反應，否則，該次樣品測定結果無效，應查明原因后重新測定。 12 12、廢棄處理 使用后的器皿及廢棄物須用121℃高壓蒸汽滅菌20min后，器皿方可清洗，廢棄物作為普通垃圾處理。
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